siRNA合成及靶點(diǎn)篩選

服務(wù)介紹  Service Introduction                                                    

        RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效特異的基因缺失性研究工具，是Andrew Fire 和Craig Mello在線(xiàn)

蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，幾乎存在于所有真核生物中。RNAi已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種真

核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選。近年來(lái)，多種臨床試驗(yàn)表明靶向致病基因的RNAi藥物具有治療困擾人類(lèi)多

年疾病的巨大潛力。

        小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA，～ 21nt dsRNA），可以引起與之序列匹配的靶基因mRNA 的降

解，從而導(dǎo)致細(xì)胞或機(jī)體產(chǎn)生基因沉默的表型。銳博生物提供人、小鼠、大鼠及其他物種的siRNA設(shè)計(jì)與合成，包括細(xì)胞

使用用標(biāo)準(zhǔn)純化siRNA、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用in vivo siRNA、化學(xué)修飾siRNA、siRNA預(yù)制文庫(kù)、定制型文庫(kù)以及普通對(duì)照和熒光

轉(zhuǎn)染對(duì)照，根據(jù)客戶(hù)需求提供從從小規(guī)模到大規(guī)模的siRNA合成服務(wù)。

        艾基生物擁有成熟高效的基因合成平臺(tái)，僅需提供目的核苷酸或氨基酸序列信息，即可人工合成任何您感興趣的基

因，包括重復(fù)、發(fā) 夾、高 GC、毒性基因等困難基因序列，完全不受基因來(lái)源限制。另可依據(jù)密碼子在不同宿主細(xì)胞的

偏愛(ài)性和不同的實(shí)驗(yàn)需求，提供免費(fèi) 的密碼子優(yōu)化服務(wù)，提高您下游實(shí)驗(yàn)的成功率。

圖 1 siRNA的作用原理示意圖

圖 2 siRNA產(chǎn)品包裝盒

服務(wù)特色  Service Advantages

        常規(guī)化學(xué)合成siRNA多為19nt RNA+dTdT(3'懸垂)的RNA雙鏈分子，未經(jīng)任何化學(xué)修飾

        Sense：正義鏈，RNA，序列與靶序列相同

        Antisense：反義鏈，RNA，序列與靶序列互補(bǔ)

        dTdT：兩端懸垂，DNA，均在3'端

        還支持各種特殊修飾或突變?cè)O(shè)計(jì)

圖 3 siRNA結(jié)構(gòu)示意圖

代表性客戶(hù)文章（siRNA相關(guān)） Articles

1 Lu, Y. et al. CLP36 promotes p53 deficient sarcoma progression through suppression of atrophin-1 

interacting protein-4 (AIP-4)-dependent degradation of YAP1. 

Theranostics 12, 5051-5068 (2022). https://doi.org/10.7150/thno.72365

2 Zheng, Y. et al. A pan-cancer analysis of CpG Island gene regulation reveals extensive plasticity within 

Polycomb target genes. 

Nat Commun 12, 2485 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22720-0

3 Ye, F. et al. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells promotes c-Jun-dependent secretion 

of interleukin 8 and mediates the migration and differentiation of CD4(+) T cells. 

Stem Cell Res Ther 13, 58 (2022). https://doi.org/10.1186/s13287-022-02735-0

4 Chen, B. et al. Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the 

nuclear periphery. 

Nat Cell Biol 25, 1004-1016 (2023). https://doi.org/10.1038/s41556-023-01165-1

5 Geng, Y. et al. FTO-targeted siRNA delivery by MSC-derived exosomes synergistically alleviates 

dopaminergic neuronal death in Parkinson's disease via m6A-dependent regulation of ATM mRNA. 

J Transl Med 21, 652 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-04461-4

6 Lin, X. et al. Activation of STING signaling aggravates chronic alcohol exposure-induced cognitive 

impairment by increasing neuroinflammation and mitochondrial apoptosis. 

CNS Neurosci Ther 30, e14689 (2024). https://doi.org/10.1111/cns.14689

7 Zhang, Y. et al. Glutamine suppresses senescence and promotes autophagy through glycolysis 

inhibition-mediated AMPKα lactylation in intervertebral disc degeneration. 

Commun Biol 7, 325 (2024). https://doi.org/10.1038/s42003-024-06000-3

8 Liu, Y. et al. SLC25A22 as a Key Mitochondrial Transporter Against Ferroptosis by Producing Glutathione 

and Monounsaturated Fatty Acids. 

Antioxid Redox Signal 39, 166-185 (2023). https://doi.org/10.1089/ars.2022.0203

9 Bao, J. et al. Upregulated TIMP1 facilitates and coordinates myometrial contraction by decreasing 

collagens and cell adhesive capacity during human labor. 

Mol Hum Reprod 29 (2023). https://doi.org/10.1093/molehr/gaad034

10 Hu, H. et al. Thrombospondin-1 Regulates Trophoblast Necroptosis via NEDD4-Mediated 

Ubiquitination of TAK1 in Preeclampsia. 

Adv Sci (Weinh) 11, e2309002 (2024). https://doi.org/10.1002/advs.202309002

FAQ

• 1. siRNA是什么？

   

      siRNA（small interfering RNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。它在細(xì)胞中通過(guò)與互補(bǔ)的mRNA

      結(jié)合并誘導(dǎo)其降解，從而抑制特定基因的表達(dá)。

• 2. siRNA的作用機(jī)制是什么？

      siRNA的作用機(jī)制主要包括以下步驟：

      長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）被Dicer酶切割成21-25個(gè)核苷酸的siRNA，siRNA被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，

      在RISC中，siRNA的正義鏈被降解，反義鏈作為引導(dǎo)鏈，引導(dǎo)鏈與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，RISC中的核酸酶切割靶

      mRNA，導(dǎo)致其降解，從而抑制基因表達(dá)。

• 3. siRNA有哪些應(yīng)用？

   

      基因功能研究：通過(guò)特異性敲低基因表達(dá)，研究基因在細(xì)胞中的功能。

      藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證：用于驗(yàn)證潛在藥物靶點(diǎn)的有效性。

      疾病治療：理論上可以沉默任何與疾病相關(guān)的基因，用于治療多種疾病。

      基因沉默工具：在基因沉默研究中被廣泛應(yīng)用。

• 4. 如何設(shè)計(jì)siRNA？

   

      選擇GC含量在30%-52%的序列，避開(kāi)5'和3'端的非編碼區(qū)；比對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，排除與其他編碼序列同源的序列；合

      成多個(gè)靶序列的siRNA，篩選出最有效的序列；設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

• 5. siRNA轉(zhuǎn)染方法有哪些？

   

      常見(jiàn)的siRNA轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE葡聚糖、機(jī)械法（如顯微注射和基因槍?zhuān)┖完?yáng)離子脂質(zhì)體

      試劑轉(zhuǎn)染法。其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是最常用的方法。

• 6. siRNA在體內(nèi)應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)有哪些？

  
  

      穩(wěn)定性差：易被血液中的核酸內(nèi)切酶水解。

      細(xì)胞膜滲透性差：帶負(fù)電荷的siRNA難以穿透細(xì)胞膜。

      脫靶效應(yīng)：可能干擾與靶mRNA部分同源的其他mRNA。

      免疫反應(yīng)：過(guò)長(zhǎng)的siRNA可能激活免疫反應(yīng)。

• 7. 如何提高siRNA的穩(wěn)定性和遞送效率？

  
  

      化學(xué)修飾：通過(guò)糖修飾、磷酸鹽主鏈修飾或堿基修飾提高siRNA的穩(wěn)定性；

      使用遞送系統(tǒng)：如納米載體、適體、多肽、蛋白質(zhì)和抗體等。

• 8. siRNA與miRNA的區(qū)別是什么？

  
  

      來(lái)源：siRNA是人工合成的，miRNA是內(nèi)源的。

      結(jié)構(gòu)：siRNA是雙鏈RNA，miRNA是單鏈RNA。

      作用位置：siRNA可作用于mRNA的任何部位，miRNA主要作用于靶基因的3'-UTR區(qū)。

siRNA-靶基因敲低效率驗(yàn)證

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法 Methods

轉(zhuǎn)染效率對(duì)不同的細(xì)胞株和不同的轉(zhuǎn)染試劑是不同的。我們僅以轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000為例說(shuō)明轉(zhuǎn)染方法。為

了降低細(xì)胞密度、試劑用量，轉(zhuǎn)染效率等因素導(dǎo)致的孔間差異，保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和可重復(fù)性，我們建議：

        1.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；

        2.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置建議：

                1）熒光對(duì)照siRNA組（檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率）；

                2）空白對(duì)照組（不含轉(zhuǎn)染試劑和siRNA）；

                3）轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（不含siRNA）；

                4）陰性對(duì)照siRNA組；

                5）陽(yáng)性對(duì)照siRNA組；

                6）實(shí)驗(yàn)siRNA組；

        3.接種細(xì)胞時(shí)，每孔接種的細(xì)胞數(shù)量盡量保持一致，盡量使細(xì)胞在各孔的表面平均分布。

一、轉(zhuǎn)染濃度

        1) 為了獲得最佳基因阻斷結(jié)果，每一種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA的量都需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。如果您是首次轉(zhuǎn)染您的細(xì)胞系，

推薦嘗試使用幾個(gè) LipofectamineTM 2000的濃度，并在20-100nM范圍內(nèi)改變siRNA的濃度，以確定達(dá)到最佳基因阻斷

水平所需要的條件。高濃度的 siRNA可能具有細(xì)胞系依賴(lài)性。

        2) 在30-50％細(xì)胞匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通常基因沉默分析至少要在轉(zhuǎn)染后24-72h進(jìn)行。低密度轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以使轉(zhuǎn)染

和分析之間更長(zhǎng)的間隙更長(zhǎng)，從而使由于細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)造成的細(xì)胞活性損害減少到最低。根據(jù)靶基因的特性，高密度轉(zhuǎn)染

的細(xì)胞可能更加適合條件的優(yōu)化。 

        3) 不要在轉(zhuǎn)染時(shí)的培養(yǎng)基中加入抗生素，因?yàn)檫@將會(huì)降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率和導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        4) 為獲得更好的結(jié)果，可以使用Invitrogen的Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基在形成復(fù)合物前稀釋LipofectamineTM 2000

和siRNA?？梢允褂脽晒鈽?biāo)記的siRNA幫助優(yōu)化細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件。一旦確定了用來(lái)轉(zhuǎn)染的最佳條件，可以在每一次實(shí)驗(yàn)

都包括熒光標(biāo)記siRNA，作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑。

二、轉(zhuǎn)染步驟

        以L(fǎng)ipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染siRNA于24孔板，轉(zhuǎn)染濃度為50nM為例，其他規(guī)格容器轉(zhuǎn)染請(qǐng)參考表2。

        注:轉(zhuǎn)染成功是siRNA 發(fā)揮作用的前提，寡核酸轉(zhuǎn)染效率主要為細(xì)胞性質(zhì)和轉(zhuǎn)染方法所決定，需要選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)

染率高且毒性低的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法。

        1）接種細(xì)胞

        貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24h，在400uL無(wú)抗培養(yǎng)基中接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為50-70%。(注：鋪板時(shí)要

將細(xì)胞消化完全、混勻，避免細(xì)胞堆積生長(zhǎng)。)

        懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前24h，在400uL無(wú)抗培養(yǎng)基中接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在4-8×105/孔。 

        注：需根據(jù)細(xì)胞的增殖速度、對(duì)轉(zhuǎn)染的毒性反應(yīng)以及檢測(cè)時(shí)間等調(diào)整轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度，除特定實(shí)驗(yàn)  (如劃痕實(shí)驗(yàn)等)外，

一般以到檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)細(xì)胞未完全長(zhǎng)滿(mǎn)為宜。

        2）轉(zhuǎn)染步驟

        A. 用50uLOpti-MEM稀釋siRNA(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為50nM)，輕輕吹吸3-5次混勻。

        B. 輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50uL Opti-MEM 稀釋1.0uL LipofectamineTM 2000，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。

        C. 混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。

        注：混合液可室溫放置一段時(shí)間，但不宜超過(guò) 24h

        D.轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到24孔細(xì)胞板中，100uL/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。

        注：轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入至原細(xì)胞培養(yǎng)基中一般無(wú)需移除或更換，  但亦可依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化

        E.細(xì)胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48h。轉(zhuǎn)染4-6h后可換新鮮培養(yǎng)基。

表2 使用lipofectamine2000(invitrogen) 轉(zhuǎn)染siRNA產(chǎn)品用量參考

V1：完全或不完全培養(yǎng)基；v2:Opti-MEM? I (無(wú)血清、無(wú)抗生素，轉(zhuǎn)染專(zhuān)用)

注：表中數(shù)據(jù)僅供參考，對(duì)于部分細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)染試劑用量可進(jìn)一步優(yōu)化。

        3） 效果檢測(cè)

        轉(zhuǎn)染完成后24-72h均可進(jìn)行siRNA沉默效果檢測(cè)，最佳檢測(cè)時(shí)間與細(xì)胞類(lèi)型，轉(zhuǎn)染試劑，檢測(cè)目的等相關(guān)。

        1）RNA水平的檢測(cè)：mRNA是檢測(cè)siRNA 沉默效率的最佳指標(biāo)，siRNA轉(zhuǎn)染后24-72h即可檢測(cè)到靶基因mRNA表達(dá)明

顯降低，檢測(cè)方法宜采用qPCR檢測(cè)方法。

        注：引物設(shè)計(jì)質(zhì)量很重要，需要確保檢測(cè)引物有效性。

        2）蛋白水平的檢測(cè)：蛋白是RNAi沉默效率的重要指標(biāo)，其檢測(cè)手段主要為Western Blot等。檢測(cè)時(shí)間受細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)

表達(dá)量、半衰期等因素的影響，一般為 48-96h。

        3）功能篩選：應(yīng)用EdU細(xì)胞增殖、EdUTP細(xì)胞凋亡等方法進(jìn)行細(xì)胞功能篩選。

        對(duì)照轉(zhuǎn)染圖：

        敲低效率驗(yàn)證：