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微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）檢測試劑盒產(chǎn)品說明書 

（PCR-毛細(xì)管電泳法）

前言

  微衛(wèi)星(Microsatellite)是遍布于人類基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列。與正常組織相比，腫瘤組織的微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而導(dǎo)致微衛(wèi)星長度的改變，就叫做微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)。研究表明，MSI是由錯配修復(fù)(MMR)基因發(fā)生缺陷引起的，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。臨床上已將MSI作為結(jié)直腸癌預(yù)后和制定輔助治療方案的重要分子標(biāo)志物，并應(yīng)用于協(xié)助Lynch綜合征篩查。

產(chǎn)品介紹

  本試劑盒采用多重?zé)晒釶CR的方法對檢測位點進(jìn)行擴(kuò)增，通過毛細(xì)管電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并利用分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。其主要優(yōu)點是檢測準(zhǔn)確全面、操作簡單快捷、結(jié)果直觀易讀等。

檢測位點

  Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27

產(chǎn)品編號

  P600-S（16人份/盒）

儲存條件及有效期

  1.收到干冰或冰袋冷凍運輸?shù)脑噭┖泻?，如暫時不用，請置于-20±5℃長期保存。  

  2.有效期：-20℃保存12個月，如開啟使用，盡量避免反復(fù)凍融，試劑盒反復(fù)凍融 5 次內(nèi)有效，開瓶兩個月內(nèi)有效。 

擴(kuò)增前試劑盒

擴(kuò)增后試劑盒

實驗所需主要儀器設(shè)備

      PCR 擴(kuò)增儀、ABI 毛細(xì)管電泳儀（3500、3730 等）、96 孔板式離心機(jī)、潔凈工作臺、微量移液器、 冰箱等。 

試劑盒使用方法（試劑使用前請輕微振蕩，并短暫離心）

1、基因組 DNA 準(zhǔn)備

  請使用全基因組DNA提取試劑盒對待檢樣品進(jìn)行全基因組DNA進(jìn)行提取。例如：廣州艾基生物技術(shù)有限公司： iPure 細(xì)胞/血液/動物組織gDNA提取試劑盒（K316-L）等試劑盒。

2、PCR 擴(kuò)增

      2.1 PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系（PCR 反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用，若配制多余可-20℃保存一周，勿反復(fù)凍融。）

      2.2 PCR 程序

  備注：因各地PCR儀性能不同，循環(huán)參數(shù)中的退火溫度可適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整范圍±2℃內(nèi)。亦可根據(jù)模板DNA量和檢測信號強度來調(diào)整熱循環(huán)次數(shù)。

3、毛細(xì)管電泳檢測

  將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3000rpm離心1分鐘，取1μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL LIZ-500和9 μL去離子甲酰胺（去離子甲酰胺需要自備）混合，將96孔板離心后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

4、數(shù)據(jù)分析

  1. 導(dǎo)入panel和bin之后，使用GeneMapper對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定評判標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判斷。(Panel,bin文件請聯(lián)系公司索取。)

  2.判斷標(biāo)準(zhǔn)：

   （1）高度不穩(wěn)定（MSI-H）：5個分子標(biāo)記中含有2個或以上出現(xiàn)變異。

   （2）低度不穩(wěn)定（MSI-L）：5個分子標(biāo)記中只有1個出現(xiàn)變異。

   （3）微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）：  5個分子標(biāo)記中未出現(xiàn)變異。

  3.峰圖實例：

圖1：高度不穩(wěn)定（MSI-H）

圖2：微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）

樣本要求

   樣本類型：人 EDTA 抗凝全血。 

   樣本保存：血液樣本一經(jīng)采集應(yīng)盡快送檢；或-20℃±5℃保存，24 個月內(nèi)檢測?；蚪M DNA 一經(jīng)提取應(yīng)盡快檢測；或 2~8℃保存，4 周內(nèi)檢測；或-20℃±5℃保存，24 個月內(nèi)檢測， 凍融不超過 5 次。 

樣本DNA質(zhì)量要求：DNA 應(yīng)保證 OD260/OD280在 1.6~2.0 之間，濃度≥10 ng/μL。

注意事項

   1.請在使用前仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書。 

   2. 實驗室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施和防護(hù)程序，實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照 PCR 實驗 室的管理規(guī)范，實驗操作人員應(yīng)具備基因擴(kuò)增等相關(guān)實驗操作資格。PCR 相關(guān)操作應(yīng)嚴(yán)格 按照國家有關(guān)規(guī)定進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)。實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段 用品不能交叉使用，防止核酸的交叉污染。 

   3. 實驗中使用的離心管、吸頭，應(yīng)無菌及無核酸酶。 

   4. 實驗過程中需穿戴防護(hù)衣物、一次性手套、口罩。 

   5. 檢測過程中剩余的樣品、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及污染的試劑和耗材等，需按相關(guān)法規(guī)條例來消 毒和處理。 

   6. 在有效期內(nèi)使用試劑盒，不同批號的試劑切勿混用。 

   7. 酶混合液相關(guān)操作應(yīng)在冰上進(jìn)行。其他試劑使用前應(yīng)完全解凍并混合均勻，盡量避免反 復(fù)凍融。 

   8.加樣時，所有液體都要緩慢加至管底，不要殘留在管壁上，不能用手直接觸摸 PCR 管管蓋。

   9.若樣本存在質(zhì)量問題時，如嚴(yán)重降解或含有 PCR 抑制劑等，檢測結(jié)果可能出現(xiàn)雜峰或 目的擴(kuò)增產(chǎn)物丟失，影響結(jié)果判斷。

參考文獻(xiàn)

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